Ibidi 3孔/8孔/12孔可移除腔室載玻片

**熒光實驗

ibidi提供了一種簡單且經(jīng)濟(jì)高效的方案，使用一片可移除的腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，固定和染色，無需爬片，是倒置/正置顯微鏡以及長期樣品儲存的理想選擇。

本應(yīng)用提供了一種使用ibidi8孔可移除腔室載玻片（80841）培養(yǎng)、固定和染色細(xì)胞的簡單方案。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并用福爾馬林溶液固定。細(xì)胞核用DAPI染色，肌動蛋白骨架用DYE-490鬼筆肽染色。利用**和二級抗體染色，通過**細(xì)胞化學(xué)可以探測其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。

實驗使用的材料和試劑：

· 8孔可移除腔室載玻片（ibidi，80841）

· 可移除腔室載玻片用的蓋玻片，24 x 60 mm（ibidi，10811）

· 細(xì)胞：MCF-7（CLS，300273）

· 細(xì)胞培養(yǎng)基

· 細(xì)胞培養(yǎng)試劑

· PBS緩沖液

· 福爾馬林中性緩沖液，10％（Sigma，HT5011）

· 染色試劑

o  DAPI（Sigma，D954）

o  DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics，490-33）

· 封片劑：Fluoroshield^TM（Sigma，F(xiàn)6182）

實驗方案

細(xì)胞培養(yǎng)，固定，染色和成像觀察--都是在一個開放型小室中搞定：）

步驟1：

必須在預(yù)實驗中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用4-6x10⁴細(xì)胞/ ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。

1.在無菌條件下，打開8孔可移除腔室載玻片（ibidi，80841）包裝。

2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞濃度為5×10⁴細(xì)胞/ ml MCF-7。

3. 將400微升細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個孔中。避免搖晃，因為這會導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO₂下培養(yǎng)。細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時，或直到建立融合的單層。

步驟2：

固定是染色程序的**步。目標(biāo)是將細(xì)胞，細(xì)胞形成物或組織維持在其當(dāng)前狀態(tài)，并在較長時間內(nèi)通過化學(xué)試劑保存。

1.小心地吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.用PBS洗兩次。

3.加入400μl福爾馬林溶液。

4.在室溫下孵育30分鐘。

5.小心吸入福爾馬林溶液。

6.用PBS洗滌三次。

步驟3：

應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動蛋白骨架。

1.準(zhǔn)備你的染色溶液：

· PBS

· DYE-490鬼筆環(huán)肽

· DAPI 1μg/ml

2.小心吸出PBS。

3.移取400μl染色溶液到每個孔中

4.在室溫下避光孵育30分鐘

步驟4：

染色后清洗樣本可*大限度地減少背景信號

1.小心地吸出染色溶液

2.加入400μl緩沖液

3.小心地吸出緩沖液

4.重復(fù)步驟2和步驟3至少一次

步驟5：

從一個邊緣開始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行，以避免損壞細(xì)胞層。

步驟6：

完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水。

1.將載玻片側(cè)面在干凈的實驗室濕巾上輕敲，去除樣品中多余的介質(zhì)。

2.將封固劑涂在樣品上。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品，小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上，以避免夾住任何氣泡。

Tip：建議使用硬化封片劑，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。

3.等封片劑固定好。

步驟7：顯微觀察

在可移除8孔腔室載玻片中**染色的MCF-7細(xì)胞的熒光顯微鏡檢查。綠色：α-微管蛋白，紅色：F-肌動蛋白（鬼筆環(huán)肽），藍(lán)色：細(xì)胞核 (DAPI)。使用20倍物鏡拍攝寬場熒光圖像。

**熒光實驗實例

人眼的小梁網(wǎng)細(xì)胞，在 ibidi 8 Well Chamber 8孔可移除載玻片中。F-肌動蛋白絲顯示為綠色；細(xì)胞核被 DAPI（藍(lán)色）染色。圖片由中國香港香港理工大學(xué)視光學(xué)院的Samantha Shan提供。

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